BIOTEKNOLOGI

A.   Prinsip Dasar dan Jenis-Jenis Bioteknologi

1.      Prinsip Dasar Bioteknologi

Bioteknologi berasal dari dua kata, yaitu ‘bio’ yang berarti makhuk hidup dan ‘teknologi’ yang berarti cara untuk memproduksi barang.

Dalam batasan pengertian bioteknologi, ada beberapa ciri dari suatu proses bioteknologi. Ciri-ciri tersebut sebagai berikut.

1)      Adanya agen biologi yang dipergunakan. Agen biologi yang dipergunakan ini tidak hanya dalam bentuk fisik yang dipanen, namun juga termasuk di dalamnya adalah hasil metabolit sekunder atau enzim yang dihasilkan.

2)      Penggunaan agen biologi dilakukan dengan suatu cara atau metode tertentu.

3)      Adanya produk turunan atau jasa yang dipakai dari proses pengguaan agen biologi tersebut.

2.      Jenis-Jenis Bioteknologi

a.      Bioteknologi Konvensional

Bioteknologi konvensional merupakan praktik bioteknologi yang dilakukan dengan cara dan peralatan sederhana, tanpa melaksanakan rekayasa genetika. Praktik bioteknologi yang demikian telah dilakukan sejak ribuan tahun yang lalu untuk menghasilkan berbagai produk (barang). Contohnya bir, wine, tuak, sake, yoghurt, roti, keju, kecap, tempe, tape, dan oncom.

            Kelebihan bioteknologi konvensional:

1)      Biaya produksi lebih murah

2)      Teknologi menggunakan peralatan sederhana

3)      Pengaruh jangka panjang sudah diketahui

Kelemahan bioteknologi konvensional:

1)      Perbaikan genetic tidak terarah

2)      Memerlukan waktu relative lama

3)      Belum ada pengkajian prinsip-prinsip ilmiah

4)      Hasil tidak dapat diperkirakan sebelumnya

5)      Tidak dapat mengatasi ketidaksesuaian genetic

6)      Hanya diproduksi dalam skala kecil

7)      Prosesnya relative belum seteril sehingga kualitas hasilnya belum terjamin

b.      Bioteknologi Modern

Bioteknologi modern merupakan bioteknologi yang didasarkan pada manipulasi atau rekayasa DNA, selain memanfaatkan dasar Mikrobiologi dan Biokimia. Bioteknologi modern mulai berkembang setelah penemuan struktur DNA tahun 1950, yang diikuti penemuan lainnya.

            Kelebihan bioteknologi modern:

a)      Hasil dapat diperhitungkan

b)      Dapat mengatasi kendala ketidaksesuaian genetic

c)      Perbaikan sifat genetic dapat dilakukan secara terarah

d)      Dapat menghasilkan organism yang sifat barunya tidak ada pada sifat alaminya

Kelemahan bioteknologi modern:

a)      Biaya produksi relative lebih mahal

b)      Memerlukan teknologi canggih

c)      Pengaruh jangka panjang belum diketahui

Teknik yang digunakan dalam bioreknologi sebagai berikut

1)      Kultur Jaringan

Kultur jaringan tumbuhan merupakan teknik menumbuh kembangakan bagian tanaman, baik berupa sel, jaringan, atau organ dalam kondisi aseptik secara in vitro. Kultur jaringan dapat dilakukan karena adanya sifat totipotensi, yaitu kemampuan setiap sel tanaman untuk tumbuh menjadi individu baru bila berada dalam lingkungan yang sesuai. Dalam kultur jaringan, tanaman yang akan dikulturkan sebiknya berupa jaringan muda yang sedang tumbuh, misalnya akar, daun muda, dan tunas. Bagian tumbuhan yang akan dikultur disebut sebagai eksplan.

a)      Teknik Kultur Jaringan

Tanaman dengan teknik kultur jaringan dapat diperoleh dengan empat tahap sebagai berikut.

1.      Tahap inisiasi adalah tahap penanaman eksplan ke dalam media. Media yang digunakan adalah media cair yang terdiri dari zat nutrisi dan zat pengatur tumbuh.

2.      Tahap multiplikasi (perbanyakan kultur), eksplan akan tumbuh menjadi jaringan seperti kalus berwarna putih disebut protocorm like body (PLB).

3.      Tahap menghasilkan plantlet, PLB berkembang menjadi tanaman kecil yang disebut plantlet.

4.      Tahap aklimatiasi, plantlet dipisah-pisahkan dan dikultur dalam media padat. Setelah plantlet tumbuh menjadi tanaman yang sempurna, maka tanaman tersebut dipindah ke polybag.

Kultur jaringan akan berhasil dengan baik apabila syarat-syarat yang diperlukan terpenuhi. Syarat-syarat tersebut antara lain, yaitu :

1.      Pemilihan eksplan sebagai bahan dasar untuk pembentukan kalus.

2.      Penggunaan medium yang cocok.

3.      Keadaan aseptik.

4.      Pengaturan udara yang baik.

b)      Manfaat dan Kelemahan Kultur Jaringan

Dengan melakukan kultur jaringan tumbuhan dapat diperoleh manfaat sebagai berikut.

1.      Mendapat bibik banyak dalam waktu singkat yang identik dengan induknya.

2.      Bibit terhindar dari hama dan penyakit.

3.      Menghasilkan varietas baru seperti yang dikehendaki.

4.      Mendapat hasil metabolisme tumbuhan (metabolit sekunder), misalnya karet, resin,tanpa areal tanaman yang luas dan tidak perlu menunggu tumbuhan dewasa.

5.      Melestarikan tanaman-tanaman  yang hampir punah.

Selain memiliki manfaat, kultur jaringan juga memiliki kelemahan-kelemahan yaitu sebagai berikut.

1.      Diperlukan biaya yang relatif tinggi.

2.      Hanya mampu dilakukan oleh orang-orang tertentu saja, karena memiliki keahlian khusus.

3.      Bibit hasil kultur jaringan memerlukan proses aklimatiasi, karena terbiasa dalam kondisi lembap dan aseptik.

2)      Rekayasa Genetika

            Rekayasa genetika adalah suatu proses perubahan gen-gen dalam tubuh makhluk hidup. Rekayasa genetika dilakukan dengan cara mengisolasi dan mengidentifikasi serta memperbanyak gen yang dikehendaki.

Teknik rekayasa genetika  dapat dilakukan melalui :

1.      Rekombinasi DNA

            Rekombinasi DNA adalah proses penyambung 2 DNA dari organisme yang berbeda. Hasil penggabungan DNA dari individu yang tidak sama inj disebut dengan DNA rekombinan. Gen dari satu individu yang disisipi atau digabungkan pada gen individu yang lain disebut transgen, individunya disebut transgenik. Rekombinasi DNA dapat terjadi secara alami dan buatan. Secara alami dapat terjadi dengan cara :

a.       Pindah silang, yaitu tukar menukar kromatid pada kromosom homolog sehingga DNA terputus dan tersambungkan secara silang.

b.      Transduksi,yaitu bersambungnya DNA bakteri yang satu dengan bakteri yang lain dengan prantara virus.

c.       Tranformasi, yaitu pemindahan sifat-sifat dari satu mikroba ke mikroba lainnya melalui bagian-bagian DNA tertentu dari mikroba pertama.

            Rekombinasi DNA secara buatan dilakukan dengan penyambungan DNA secara in vitro. Alasan dilakukan rekombinasi DNA ini adalah :

a)      Strutur DNA semua spesies sama.

b)      DNA dapat disambung-sambungkan.

c)      Ditemukan enzim pemotong dan penyambung.

d)     Gen dapat terekspresi  di sel apapun.

2.      Teknik Hibridoma/Fusi Sel.

            Teknik hibridoma adalah penggabungan 2 sel dari organisme berbeda ataupun sama (fusi sel) sehingga menghasilkan sel tunggal berupa sel hybrid (hibridoma) yang memiliki kombinasi sifat dari kedua sel tersebut. Proses penggabungan sel menggunakan tenaga listrik, sehingga prosesnya disebut elektrofusi.

Hal-hal yang diperlukan dalam teknik hibridoma, yaitu :

a)      Sel umber gen adalah sel-sel yang memiliki sifat yang diinginkan.

b)     Sel wadah adalah sel yang mampu membelah dengan cepat (misalnya sel mieloma).

c)      Fusi gen adalahza-zat yang mempercepat fusi sel (misalnya NaNO₃).

Teknik hibridoma dapat dimanfaatkan untuk pembuatan produk penting, misalnya antibodi monoclonal, pembentukan spesies baru, dan pemetaan kromosom.

3.      Kloning

            Kloning berasal dari bahasa inggris clonning yang berarti suatu usaha untuk menciptakan duplikat suatu organisme melalui proses aseksual. Tujuan utama kloning adalah untuk mengisolasi gen yang diinginkan dari seluruh gen yang ada (kromoson) pada organisme donor. Untuk mencapai tujuan tersebut, kloning dapat dilakukan dengan kloning embrio dan transfer inti. Kloning embrio dilakukan dengan fertilisasi in vitro, misalnya kloning pada sapi yang secara genetik identik untuk memproduksi hewan ternak. Sedangkan kloning dengan tanspfer inti yaitu pemindahan inti sel yang satu ke sel lain sehingga diperoleh individu baru yang memiliki sifat baru sesuai inti yang diterimanya. Kloning dengan transfer inti dilakukan dengan menggunakan sel somatis sebagai sumber gen. Contoh kloning dengan transfer inti adalah domba Dolly.

3)      Bayi Tabung

Bayi tabung adalah bayi hasil konsepsi atau pertemuan antara sel telur dan sperma yang terjaadi didalam sebuah tabung yang dilakukan di laboratorium tabung yang akan digunakan untuk mempertenukan sel telur dan sperma dibuat sedemikian rupa sehingga kondisinya menyerupai tempat secara alami, yaitu oviduk ( saluran telur ) seorang perempuan.

Proses bayi tabung diawali dengan pengambilan sel telur dari seorang perempuan yang baru saja mengalami ovulasi kemudian , sel telur yang diambil tadi dibuahi dengan sperma yang sudah dipersiapkan dalam tabung yang kondisinya telah diatur sedemikian rupa. Setelah terjadi pembuahan, hasil pembuahan dipelihara beberapa saat dalam tabung tadi hingga mencapai tahap tertentu , lalu ditanamkan kedalam rahim perempuan tadi. Selanjutnya , diharapkan embrio tersebut akan tumbuh sebagai mana layaknya janin pada umumnya.

B.   Penerapan Bioteknologi dan Dampaknya

1.      Penerapan Bioteknologi

a.      Bidang Pangan

1) Pemanfaatan Mikroorganisme dalam Proses Fermentasi

No.	Bahan Pangan	Mikroorganisme	Golongan	Produk
1	Susu	Lactobacillus bulgaricus Streptococcus termophillus Streptococcus lactis Panicillium requiforti Propioni bacterium Lactobacillus casei	Bakteri Bakteri Bakteri Jamur Bakteri Bakteri	Yoghurt Yoghurt Mentega Keju Keju Swiss Susu asam
2	Kedelai	Rhizopus oligosporus Rhizopus stoloniferus Rhizopus oryzae Aspergillus oryzae	Jamur Jamur Jamur Jamur	Tempe Tempe Tempe Kecap
3	Kacang tanah	Neurospora sitophyla	Jamur	Oncom
4	Beras	Saccharomyces cereviseae Endomycopsis fibulegera	Jamur Jamur	Tape Ketan
5	Singkong	Saccharomyces elipsoides Endomycopsis fibulegera	Jamur Jamur	Tape singkong
6	Air kelapa	Acetobacter xylinum	Bakteri	Nata de coco
7	Tepung gandum	Saccharomyces elipsoides	Jamur	Roti
8	Kubis	Enterobacter sp.	Bakteri	Asinan
9	Padi-padian atau umbi-umbian	Saccharomyces cereviseae Saccharomyces caelsbergensis	Jamur	Minuman beralkohol
10	Mikroorganisme	Spirulina Chlorella	Alga bersel satu	Protein sel tunggal

2) Pemanfaatan Mikroorganisme untuk Memproduksi Bahan Makanan

a)          Protein Sel Tunggal (PST)

Beberapa jenis mikroorganisme  merupakan sumber protein. Pretein yang dihasilkan mikroorganisme dinamakan protein sel tunggal (PST) atau Single Cell Protein (SCP). Protein sel tunggal diperoleh dari bakteri, ganggang, kapang berfilamin, maupun khamir. Beberapa contoh mikroorganisme yang digunakan sebagai sumber PST antara lain ganggang hijau dari genus Chlorella, Spirulla, dan Scenedesmus. Khamir biasanya Candida utilis, dan jamur misalnya Fusarium gramineaum. PST yang berupa miselium jamur sering disebut mikroprotein.

ü  Kelebihan Penghasil Protein Tunggal (PST)

1)      Secara umum, organisme dapat membelah diri dengan cepat.

2)      Tidak memerlukan lahan yang terlalu luas.

3)      Dapat hidup ditempat limbah buangan, seperti selulosa, limbah minyak bumi atau limbah organik yang lain.

4)      Mikroorganisme fotosintetik seperti ganggang dapat memanfaatkan energi cahaya untuk digunakan sebagai penghasil PST.

ü  Kekurangan Penghasil Protein Tunggal (PST)

1)      PST memiliki dinding sel yang terjadi atas selulosa, khususnya ganggang, sedangkan manusia tidak dapat mencerna selulosa.

2)      PST yang dihasilkan kurang menarik, seperti jeli.

3)      Kandungan asam nukleat (DNA dan RNA) dari PST cukup tinngi dan sulit dicerna serta dapat menimbulkan asam urat.

b.      Bidang Pertanian dan Peternakan

ü  Bidang Pertanian

            a.       Tanaman Transgenik

Rekayasa genetika dapat dilakukan pada berbagai jenis tanaman untuk menghasilkan tanaman dengan sifat yang dikehendaki manusia disebut tanaman transgenic.Tanaman transgenik yaitu tanaman yang telah disisipi gen bakteri. Berikut ini contoh tanaman transgenic.

1.      Tanaman Kebal Hama dan Penyakit TMV (Tobacco Mozaic Virus).

Pembentukan tanaman tahan hama TMV pada tanaman tembakau dilakukan dengan rekayasa genetika menggunakan teknik rekombinasi gen dan kultur sel. Dengan menyisipkan gen yang kebal terhadap penyakit maka dapat menghasilkan tanaman kebal penyakit pula. Vektor penyisip gen yang digunakan adalah plasmid dari bakteri Agrobacterium tumefaciens.

2.       Tanaman yang Mampu Mengikat Nitrogen.

Tanaman hasil rekayasa genetika dapat mengikat nitrogen dari udara bebas. Cara yang digunakan yaitu dengan menginjeksi tanaman dengan bakteri Rhizobium. Di dalam bakteri tersebut telah ditransfer gen-gen tertentu dari bakteri lain yang menginfeksi tanaman selain dari familia Leguminoceae. Hasil akhirnya, bakteri tersebut mampu mengikat nitrogen setelah diinjeksikan ke dalam tanaman selain dari familia Leguminoceae.

3.      Mikroorganisme Pembasmi Hama Tanaman.

Mikroorganisme dapat digunakan untuk pengendalian hama dan penyakit secara biologi yang disebut dengan biopeptisida mikroba.

ü  Bidang Peternakan

a.       Hewan Transgenik.

Hewan transgenik adalah hewan yang telah disisipi gen-gen tertentu yang dibutuhkan manusia.Contoh: domba transgenic yang dapat menghasilkan susu untuk menolong penderita hemophilia karena mengandung protein pembeku darah.

b.        Hormon BGH (Bovine Growth Hormone) atau BST (Bovine Somatotropin).

Hormon BGH adalah hormone pemacu pertumbuhan hewan ternak.Penyuntikan hormone BGH pada sapi perah ternyata dapat meningkatkan produksi susu selain meningkatkan produksi daging.

c.       Bidang Kedokteran

1.      Insulin

Sel bakteri yang biasa digunakan dalam pembuatan insulin adalah bakteri E.coli.Proses pembuatan insulin tersebut adalah sebagai berikut.

a.       Sel bakteri  E.coli diambil plasmidnya.

b.      Gen insulin dari sel hewan diambil dan disambungkan ke dalam plasmid bakteri sehingga membentuk kimera (DNA rekombinan).

c.       Kimera tersebut dimasukkan ke dalam sel bakteri E.coli.

d.      Bakteri E.coli tersebut dikulturkan untuk dikembangbiakkan.

e.       Bakteri-bakteri hasil pembelahan mengandung plasmid yang sama dengan bakteri semula sehingga mampu juga menghasilkan  insulin.

2.      Antibodi Monoklonal

Antibodi monoklonal adalah antibody yang diperoleh dari suatu sumber tunggal atau sel klona yang hanya mengenal satu jenis antigen.

Antibodi monoklonal memiliki manfaat, yaitu :

1)      Mendeteksi hormone carionik gonadotropin (HCG) dalam urine wanita hamil.

2)      Mengikat racun dan menonaktifkannya

3)      Mencegah penolakan jaringan terhadap hasil transplantasi jaringan lain.

3.      Vaksin

Teknologi rekombinasi DNA juga digunakan dalam pembuatan  vaksin.Prinsip-prinsip rekayasa genetika dalam pembuatan vaksin adalah sebagai berikut.

1)      Mengisolasi gen-gen dari organisme penyebab sakit yang berperan dalam mengasilkan antigen.

2)      Menyisipkan gen-gen tersebut ke tubuh organisme yang kurang patogen.

3)      Mengulturkan organisme hasil rekayasa  sehingga menghasilkan antigen dalam jumlah banyak.

4)      Mengekstraksi antigen,lalu digunakan sebagai vaksin.

4.            Antibiotik

Antibiotik merupakan senyawa yang dihasilkan oleh mikroorganisme,dimana senyawa tersebut mampu menghambat pertumbuhan mikroorganisme lain.Pada tahun 1924 Alexander Flemming menemukan zat antibiotic dari jamur Peniillium notatum yang disebut penisilin.Berikut ini beberapa contoh antibiotik yang dihasilkan oleh mikroorganisme.

No	Mikroorganisme	Antibiotik
1	Streptomyches griseus	Streptomisin
2	Streptomryches erythreus	Erythromycin
3	Streptomryches noursei	Nystatin
4	Penicilium chrysogenum	Penisilin
5	actinomycetes	Actinomisetin
6	Bacillus polymyxa	Polymixin B
7	Bacillus licheniforis	Bagitracin

                      

Pembuatan antibiotik terdiri dari beberapa tahap yaitu:

1)      Microorganisme penghasil antibiotic dikembangbiakan

2)      Mikroorganisme dipindahkan kedalam bejana fermentasi dan di pacu dengan lingkungan yang cocok agar berkembang biak secara tepat.

3)      Antibiotic dari cairan biakan diekstraksi dan dimurnikan, selanjutnya diuji

5.      Interferon

Interferon merupakan suatu senyawa anti virus yang dapat mengobati beberapa jenis kanker dan beberapa jenis leukemia. Selain itu interferon juga berfungsi untuk mengobati hepatitis, herpes simpleks, dan herpes zooter. Interferon dihasilkan melalui fusi gen.

6.      Terapi genetik

Terapi genetic adalah perbaikan kelainan genetic dengan memperbaiki gen. Setiap kelainan genetic yang disebabkan alel tunggal yang rusak, secara teoritis mungkin untuk diganti dengan alel yang masih berfungsi normal. Dengan mengetahui alel tunggal yang rusak maka dapat diupayakan untuk memperbaiki atau , mengganti gen yang rusak dengan teknik rekombinasi gen atau terapi genetic. Agar gen yang disisipkan atau diganti dalam terapi genetic bersifat permanen maka sel-sel yang diterapi haruslah sel yang memperbanyak diri sepanjang hidupnya (sel sumsum tulang) sehingga alel yang dicangkokan dapat bereplikasi dan terus diekspresikan. Terapi genetic dapat dilakukan untuk mengobati penyakit immunodefisiensi atau penyakit tidak memiliki kekebalan tubuh karena sel T limfosit tidak mampu memproduksi hormone adenosine deaminase (ADA). Terapi lain yang sudah dilakukan, yaitu untuk mengobati kanker kulit.

d.      Bidang Lingkungan

a)      Pengolahan Limbah Cair

Limbah cair organic dapat diuraikan oleh bakteri anaerob menghasilkan bahan bakar alternative (biogas).

b)      Pengolahan Sampah/Limbah padat

Pengolahan sampah dengan bantuan mikroba adalah dengan cara pengomposan sampah-sampah organic. Pengomposan dapat dilakukan dengan aerobic maupun anaerobik.

c)       Plastik Biodegradable

Mikroba yang mampu membuat plastic biodegradable antara lain Alxaligenes eutrophus. Plastic biodegradable lainnya adalah pululan yang diproduksi oleh Aureobasidium pullulans.

d)      Pengolahan Limbah Minyak

     Mikroorganisme yang berperan dalam mengatasi limbah minyak, yaitu Pseudomonas,

Acinetobacter calcoacetinius, Zhantomonas campestris

2.      Dampak Bioteknologi

a.      Dampak positif

ü  Bioteknologi dapat mengatasi kekurangan bahan makanan (protein dan vitamin).

ü  Membantu mengatasi masalah kesehatan dengan menyediakan obat-obatan untuk memberantas penyakit secara lebih murah.

ü  Menyediakan berbagai senyawa organik seperti alkohol, asam asetat, gula, bahan makanan, protein, vitamin.

ü  Menyediakan energi, misalnya biogas.

ü  Memperbaiki lingkungan (misal bakteri pencerna limbah)

ü  Mengatasi kesulitan memperoleh keturunan (bayi tabung)

b.       Dampak negative

1)      Dampak terhadap lingkungan

Dampak bioteknologi terhadap lingkungan adalah timbulnya dampak yang merugikan terhadap keanekaragaman hayati disebabkan oleh potensi terjadinya aliran gen ketanaman sekarabat atau kerabat dekat.

Contoh lainnya adalah pembuatan tempe atau kecap dalam skala besar dapat mengakibatkan pencemaran lingkungan. Air limbah dan kulit kedelai dari proses pembuatan tempe, apabila dibiarkan tergenang dalam waktu cukup lama, limbah tersebut mengubah lingkungan menjadi tidak sehat. Jika air limbah itu dibiarkan mengalir ke dalam kolam-kolam ikan atau ke lahan-lahan persawahan, kehidupan ikan atau tanaman akan terganggu, bahkan bisa mati. Selain meracuni organisme yang hidup di dalam air, limbah ini juga menimbulkan bau yang tidak enak. Untukitu maka perlu ditangani secara baik agar tidak mencemari lingkungan.

2)       Dampak terhadap kesehatan

Produk rekayasa di bidang kesehatan dapat juga menimbulkan masalah serius. Contohnya adalah penggunaan insulin hasil rekayasa telah menyebabkan 31 orang meninggal di Inggris. TomatFlavr Savrt diketahui mengandung gen resisten terhadap antibiotik.Susu sapi yang disuntik dengan hormon BGH disinyalir mengandung bahan kimia baru yang punya potensi berbahaya bagikesehatan manusia.

Selain itu, di bidang kesehatan manusia terdapat kemungkinan produk gen asing, seperti, gen cry dari bacillus thuringiensis maupun bacillus sphaeericus, dapat menimbulkan reaksi alergi pada tubuh mausia, perlu di cermati pula bahwa insersi (penyisipan) gen asing ke genom inang dapat menimbulkan interaksi antara gen asing dan inang produk bahan pertanian dan kimia yang menggunakan bioteknologi.

3)      Dampak di bidang sosial ekonomi

Beragam aplikasi rekayasa menunjukkan bahwa bioteknologi mengandung dampak ekonomi yang membawa pengaruh kepada kehidupan masyarakat. Produk bioteknologi dapat merugikan petani kecil. Penggunaan hormon pertumbuhan sapi (bovinegrowthhormone: BGH) dapat meningkatkan produksi susu sapi sampai 20% niscaya akan menggusur peternak kecil. Dengan demikian, bioteknologi dapat menimbulkan kesenjangan ekonomi.

4)      Dampak terhadap etika

Dalam mengembangkan bioteknologi, etika bioteknologi harus mendapat perhatian yang utama. Bagaimanapun juga, perkembangan dalam bioteknologi tidak terlepas dari tanggung jawab manusia sebagai perilaku sekaligus makhluk etis. Maka refleksi etis terhadap apa yang sedang dilakukan manusia menjadi sangat diperlukan. Manusia hendaknya dapat merefleksikan prinsip-prinsipnya sendiri dalam seluruh aktivitasnya, termasuk dalam bidang ilmu pengetahuan dan teknologi. Bioetika, merupakan tuntutan etis yang berciri menampung segala pemikiran dan aliran tentang kehidupan, yang bersumber pada kala, budi, filsafat, agama, tradisi tanpa harus terikat dengan agama tertentu.